时候：2023-12-20 11:37:51
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1资料与体例
1.1资料烟草青枯病泥土取自贵州省烟草迷信研讨所福泉烟草青枯病病圃。五点夹杂法收罗泥土样品，取泥土表层8~20cm的土层，过0.2mm筛，去除杂质。微生物激进地域片断的扩增引物（表1）由上海生工生物无限公司分化；琼脂糖凝胶收受接管试剂盒、DNAMarker、dNTPs、DNA聚合酶、毗连酶、克隆载体等试剂购自豪连宝生物（TAKARA）无限公司；序列测定由上海生工生物无限公司实现。
1.2体例
1.2.1泥土总DNA的提取和检测接纳玻璃珠均质和液氮研磨法相连系和SDS-CTAB法，提取病圃泥土中微生物DNA，用纯化试剂盒纯化取得DNA。接纳琼脂糖凝胶电泳法检测泥土微生物总DNA和PCR扩增产品。
1.2.2PCR扩增与DNA纯化以泥土微生物总DNA为模板，8f，926r；338F，518R为引物对停止PCR扩增。反应体系全体积为25.0μL，此中模板（泥土DNA）1.0μL，正向引物和反向引物（10μmol/μL）各1.0μL，10×PCRBuffer（含有Mg2+）2.5μL，dNTP（2.5mmol/μL）1.0μL，Taq（5U/μL）0.2μL，蒸馏水补体积至25.0μL；反应法式：95℃预变性5min；94℃变性40s，55℃变性50s，72℃耽误1min，32个轮回；最后，72℃耽误10min。按照TAKARA公司凝胶收受接管试剂盒申明书操纵，对PCR扩增产品停止收受接管，用琼脂糖凝胶电泳检测收受接管产品。
1.2.3微生物多样性开端阐发激进地域文库中检测为阳性的单克隆由上海生工生物公司测序。取得的序列信息经由进程NCBI数据库(ncbi.nlm.nih.gov)及EzTaxon网站()停止在线阐发和比对。
2成果与阐发
2.1烟草青枯病泥土微生物总DNA提取琼脂糖凝胶电泳检测提取纯化后的泥土微生物总DNA，成果显现提取的DNA巨细约在2.0~10.0kb规模之间，经由进程DNA试剂盒的纯化，可以或许或许或许或许或许或许或许或许降落泥土中腐植酸和多酚类等化合物对PCR反应的影响。2.2烟草青枯病泥土微生物16S-rRNA和ITS激进序列文库构建以纯化的DNA为模板，用细菌特同性8f和926r引物、真菌特同性338F和518R引物，颠末PCR扩增，取得与预期片断巨细分歧的条带，别离在1000bp和300bp摆布。别离用8f，926r引物；338F，518R引物扩增的产品构建文库，从文库中随机挑取局部单菌落，用PCR体例检测其照顾的片断，局部琼脂糖电泳检测成果如图所示，图1标明随机挑取的大大都单菌落照顾有目标条带。阳性克隆的序列的测定由上海生工生物无限公司实现。
1.新手艺在情况工程生物处置研讨中的操纵
因为PCR-DGGE手艺降服了传统微生物学体例的规模性，自Muvzer等斥地了DGGE在微生物生态范畴研讨的先河以来，该手艺敏捷成长成为情况微生物群落布局阐发研讨的首要手腕之一。比来几年来，DGGE 用于情况微生物种群的研讨愈来愈多，触及的范畴也愈来愈遍及，在外洋DGGE手艺已被遍及用于活性污泥、生物膜等生物处置体系中的微生物多样性检测、微生物判定和种群演替等方面的研讨，在国际这方面的操纵固然处于起步阶段，但一样成为研讨的热点。
1．1在废水生物处置研讨中的操纵
PCR-DGGE手艺在废水生物处置研讨中的操纵令人们对废水处置进程中微生物群落的变更发生了新的熟悉。
Lapara等研讨了降落温度对废水好氧生物处置进程中细菌群落布局和功效的影响，DGGE阐发细菌群落的成果表现差别温度下有差别的细菌群落。
操纵PCR-DGGE体例，对在不异的操纵前提下别离用高温菌和常温菌接种的两套活性污泥体系中的微生物群落布局的静态变更停止了追踪。因为工艺不异，使得接种的高温菌群和常温菌群在不异的操纵前提下，发生了近似的微生物群落布局。跟着运转时候的增添，其菌群布局近似程度也愈来愈高。
硝化感化是废水处置体系中实现氨氮去除的关头步骤。而氨氧化细菌在硝化感化进程中担任将氨氧化为亚硝酸盐，实现亚硝化感化，是硝化进程中必不可少的步骤。但因为氨氧化细菌的成长速率相称低，生物量很少，接纳传统的细菌分手培育阐发法研讨氨氧化细菌相称费时、烦琐。许玫英等接纳PCR扩增16SrDNA、扩增功效基因、随机克隆测序等手艺，阐发处置含高浓度氨氮废水处置体系差别驯化时代的4个活性污泥样品氨氧化细菌的品种和氨单加氧酶的活性，并在国际初次接纳PCR-DGGE相连系的手艺对样品中总的细菌类群的差别停止研讨。成果标明接纳PCR-DGGE手艺有益于更周全地领会氨氧化细菌的类群和功效，进而改进废水处置体系的处置成果。
操纵PCR-DGGE手艺对都会污水化学平生物絮凝强化一级处置工艺与传统的完整夹杂式处置工艺反应池活性污泥样品微生物种群布局停止了对比研讨，对统一反应器差别地位微生物散布和差别工况下的微生物种群布局停止了开端切磋。成果标明两种都会污水处置工艺中微生物种群多样性都相称丰硕，可是种群布局相差很大。申明化学生物絮凝处置工艺的微生物感化与成份四周的都会污水处置工艺中微生物感化机理可以或许或许或许或许或许或许或许或许存在相称大的差别。
R0wan等接纳生物滴滤反应器和生物滤池处置同种废水，操纵PCR-DGGE考查了差别反应器中的氨氧化细菌菌群的构成。固然差别情势反应器或是统一反应器的差别地位中的氨氧化细菌菌群构成差别，可是首要种群是不依靠反应器的情势或是在反应器中所处的地位差别而转变的，也恰是这些首要种群在全数处置进程中阐扬侧首要的感化。
接纳PcR-DGGE手艺对处置采油废水的水解酸化一缺氧法差别生物反应器中污泥样品停止研讨，肯定了微生物的上风菌种，并停止了多样性阐发，成果显现了在差别情况前提下微生物群落布局的延续静态变更进程。
1．2 在废气生物处置研讨中的操纵
生物过滤是一种能有用处置恶臭和挥发性无机废气的气体净化节制手艺。生物滤池和生物滤塔作为生物处置恶臭气体的简略有用的体例，取得了疾速的成长。
接纳PCR-DGGE手艺研讨除臭生物滤池中试装配中别离一处于较强酸性和中性的两种差别运转情况下微生物种群的多样性和生物种群的布局变更。经由进程扩增细菌16SrRNA基因的V3可变区，连系操纵DGGE手艺阐发除臭生物滤池的生物种群的布局变更，并收受接管首要的DN段，连系PCR测序及T载体克隆测序，明白上风菌群的体系发育地位。成果标明，除臭生物滤池在差别的口H前提下，微生物的多样性及其品貌存在较大差别，强酸性对微生物具备较高的挑选感化，与中性前提比拟 微生物种群多样性绝对较低。同时在滤池的差别条理上也表现出较着的空间散布多样性差别，序列比对成果显现硫氧化细菌在除臭进程中据有上风地位。为更好地处置恶臭气体供给靠得住的迷信按照，同时也为生物除臭的操纵供给必然的实际根本。
生物滤塔中微生物的种群布局和微生物多样性对恶臭气体的处置效力和反应器的不变运转相称首要。殷峻等操纵DGGE手艺对处置含氨废气的生物滤塔中微生物多样性随时候的变更停止了研讨，经由进程比拟反应器差别填料、差别时代微生物多样性得出论断：填猜中微生物的多样性都跟着反应器运转时候的耽误而有所削减；与污泥填料和夹杂填料比拟，堆肥填料的微生物多样性程度最高，反应器的去除才能也最好。
1．3 在污泥生物处置研讨中的操纵
在污泥处置进程中，污泥的不变更是…个相称首要的进程。微生物的不变更进程对体系到达不变状态具备更间接的指点意思。傅以钢等用DGGE指纹图谱手艺对污泥堆肥工艺中的细菌种群静态变更及多样性停止了研讨。成果标明，生物法污泥堆肥周期小于8d。对污泥堆肥各工艺关头样品停止DGGE指纹图谱和近似性系数Cs值阐发，发明跟着反应的延续停止，微生态布局的Cs值愈来愈高，申明微生物种群布局愈趋不变。证明污泥微生态能敏捷停止优越劣汰的挑选，调剂外部细菌种群布局，从而达至 顺应情况的目标，在发酵进程中构成的上风细菌种群能永劫候对峙不变。
中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）13-0036-03
Study on Soil Microbial Diversity in Heavy Metal Contaminated Soil
Li Yan1 et al.
（1Anhui Huajing Resources and Environment Technology Co.，Ltd.，Hefei 230094，China）
Abstract：In this paper，the research methods of microbial diversity of heavy metal contaminated soils in recent years are summarized，and their advantages and disadvantages and their application are analyzed. The research methods of microbes are also discussed.
Key words：Heavy metal pollution；Soil microbes；Microbial diversity；Research methods
比来几年来，因为农药、化肥的大批操纵，和冶金、采矿业的迅猛成长，泥土重金属净化日益严峻[1]。重金属净化不只会严峻影响农产品和农作物的品德，并且会经由进程食物链进入人体，危险人体安康。泥土是微生物栖身的最首要情况之一，供给了微生物成长所须要的营养物资。泥土微生物品种很是丰硕，首要分为细菌、真菌、古菌和放线菌等。泥土微生物是泥土无机质和泥土营养C、N、P、S等轮回转化的能源，到场泥土中无机质的分化、腐殖质的构成、泥土营养的转化轮回等[2]。泥土微生物在泥土生态体系中表演者很是首要的脚色[3]，对情况的变更反应活络[4]，其群落多样性和绝对构成，是评估情况品德的首要参数[5]。一旦泥土生态体系遭到净化，泥土微生物就会发生呼应的变更[6]。有研讨报告指出，泥土重金属净化能较着影响泥土微生物的活性及布局[7]，李晶等[8]研讨也标明，泥土微生物对重金属勒迫出格敏感，可经由进程微生物群落布局的变更来反应泥土品德和安康状态[9]。是以，研讨泥土微生物具备很是首要的意思。本文对研讨微生物传统和各类新型研讨体例停止了分类先容，并对各类体例的优错误谬误和合用场合停止申明。
1 泥土微生物研讨体例
1.1 传统的分手纯培育和浓缩平板计数 在固体琼脂培育基上接种培育微生物，可操纵微生物的外表特色差别，在固体培育基上对微生物停止分手纯化，也可操纵该体例对微生物在平板上停止简略的计数[10]。同时可以或许或许或许或许或许或许或许或许经由进程配制差别成份的培育基对微生物停止挑选驯化，从而取得咱们须要的菌种。此种体例的长处是本钱低，便于对微生物的状态做出开端的判定。错误谬误是因为自然界中存在大批的不可培育的微生物，且存在良多对温度请求刻薄并微生物，如嗜高温菌和嗜高温菌，传统的固体培育基的培育温度并不能知足这些微生物的保管所需温度。
1.2 Biolog微平板法 Biolog微平板道理是基于测定微生物对单一碳源操纵程度的差别来表征微生物的心理特色[11]。Biolog微平板由对比孔和95种差别单一碳源孔构成并在此中增添染料，当接种纯培育的菌液时，此中一些孔的营养物资被操纵，使各孔显现出差别的色彩，从而构成微生物独有的代谢指纹，可经由进程与标准菌种的数据库做对比，从而可判定出被测菌种。与传统培育体例比拟，此体例可以或许或许或许或许或许或许或许或许预算微生物群落代谢多样性和功效多样性。同时可按照各孔的色彩差别来反应出微生物群落的平均度，从而可以或许或许或许或许或许或许或许或许反应出群落的不变性[12]。该体例的错误谬误是当情况差别不大时，这些指数并不能较敏感地辨别菌群之间的差别[13]。同时因为差别的成长和合作的成果，菌种之间会彼此影响致使种群发生变更，影响测定成果[14]。
1.3 磷酸脂肪酸阐发法（PLFA） 磷酸脂肪酸存在于活细胞的细胞膜中，具备属的特同性，差别属的微生物经由进程差别生化路子而构成差别的磷酸脂肪酸（PLFAs）[15]。是以，泥土中的PLFAs构成和含质变更在必然程度上可反应泥土中微生物量和群落的静态变更。经由进程对微生物的磷酸脂肪酸停止提取，并按照此中的特色脂肪酸唆使的微生物品种[16]，可对泥土中微生物群落特色停止表征。此种体例具备对测验考试前提请求低、无需对微生物停止培育、测试功效多和不变性好等长处[17]。但PLFA法也具备必然的规模性。该体例只能判定到属，PLFA图谱并不能给出一个实际的微生物品种构成，仅能反应微生物群落的概图[18]；别的，该体例轻易受微生物心理状态影响[19-20]；古菌不能操纵PLFA图谱停止阐发，因为它的极性脂质是以醚而不是以酯键的情势显现[21]。同时因为今朝还不成立土样中一切微生物的特色脂肪酸，并且在良多情况下，还没法肯定土样中某些脂肪酸与特定微生物或微生物群落的对应干系[22]。
1.4 变性梯度凝胶电泳手艺（PCR-DGGE） 该手艺是以庞杂的情况样品如泥土为研讨东西，间接提取微生物DNA，操纵通用引物进一步对提取的DNA停止PCR扩增。将扩增产品展开DGGE凝胶电泳阐发[23]。DGGE不是将份子量差别的DNA分隔，而是经由进程聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的差别，将序列差别的DNA分隔[24]。该体例的道理是按照DNA的解链特色，差别碱基构成的DNA双螺旋发生变性所须要的变性剂浓度差别。在通俗的聚丙烯酰胺凝胶根本上插手变性剂，按照其迁徙步履决议于其份子巨细和电荷的道理可以或许或许或许或许或许或许或许或许将长度不异但序列差别的DN段辨别开[25]。该体例具备靠得住性高、重现性强、便利疾速、分辩率高档长处[26]，但同时也存在必然的规模性。DGGE还不能周全阐发泥土中全数微生物，该体例只能检测出泥土中绝对品貌大于1%的微生物[27]；同时DGGE对测验考试请求较高，凝胶浓度、温度、电压等电泳前提挑选不那时，就会发生共迁景象[26]，即统一条带不止包罗一种微生物，微生物的品种被低估。
1.5 高通量测序手艺 高通量测序手艺也称“下一代”测序手艺，1次并行能对几十万到几百万条DNA份子停止序列测定。以Illumina公司的Solexa，ABI公司的SOLiD，和Roche公司的454手艺为代表[28-29]。该手艺对研讨泥土微生物具备极大的意思。该手艺极大公开降了微生物测序本钱，测验考试了大规模泥土微生物间接测序[30]；同时该体例极大地前进了测序通量，丰硕了研讨的信息量，便于研讨者加倍深切地领会所研讨课题。但同时该体例也存在必然的规模性，首要规模性以下：海量数据阐发难的题目，该测序体例所测数据之深，所获信息之大，都极大地加大了测验考试研讨者阐发数据的难度；数据披沙拣金难的题目，在泥土微生物高通量测序中，存在物种丰硕度被高估的情况[30]，对高通量测序成果披沙拣金，摸索新的统计学体例成为研讨者面对的一大坚苦[31]。
1.6 基因芯片手艺（GeoChip） 基因芯片（GeoChip）是研讨泥土微生物很是有用的手艺手腕，作为新一代的核酸杂交手艺，可用于检测情况微生物到场物资轮回、净化物降解等进程中到场的功效基因[32]。该体例是在芯片上含有编码各类与生态学和生物功效进程或生物降解感化有关酶的基因[33]。是以可知，功效基因芯片为泥土微生物研讨供给了全新无力的手艺阐发东西，有益于加倍有用地操纵微生物对净化泥土停止修复[34]。基因芯片手艺具备高密度、高活络度、主动化和低背景水同等较着长处[35]。可是任何手艺都存在必然的规模性，基因芯片手艺也不破例。该手艺虽能检测出微生物在生物学进程中所阐扬感化的功效基因，可是却不能间接表征微生物的群落多样性构成和丰硕度。应连系DNA与mRNA测序，可以或许或许或许或许或许或许或许或许加倍实在周全地反应泥土微生物群落布局信息及其心理勾当[34]。同时该体例在取样、标记、杂交前提、图象处置、数据归一化和所得数据的品德评估等都会带来良多偏差[36]。
2 差别体例在重金属净化泥土中的操纵
刘云国等[37]在湖南临乡桃林矿区泥土中接纳浓缩涂布法在马丁固体培育基上挑选出一株高抗铜、锌菌株；张秀等[38]操纵Biolog微平板法来阐发生物资炭对镉净化泥土微生物多样性的影响；孙婷婷等[39]操纵磷酸脂肪酸阐发法来阐发羟基磷灰石-动物连系修复对Cu/Cd净化动物根际泥土微生物群落的影响；郑涵等[40]操纵PCR-DGGE阐发体例对锌勒迫对泥土中微生物群落变更的影响停止了评估阐发；江玉梅等[41]操纵Illumina平台高通量测序手艺阐发重金属净化对鄱阳湖底泥微生物群落布局的影响；路桃香对动物非根际泥土微生物停止454高通量测序。
今朝对微生物研讨体例有良多种，有最早进的手艺，也有传统的测验考试体例，每种体例都各有优错误谬误，是以，在研讨泥土微生物时，应连系泥土特色和研讨目标公道挑选研讨体例。如前提许可的情况下，可以或许或许或许或许或许或许或许或许连系多种手艺体例同时操纵，可以或许或许或许或许或许或许或许或许更好地研讨泥土微生物的群落特色。
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中图分类号：Q938.1+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）06-1443-04
泥土微生物是丛林生态体系中最首要的组分，在凋谢物分化、腐殖质分化和营养轮回等进程中起着很是首要的感化。其品种和构成不只间接影响泥土的生归天学轮回，并且是泥土生物活性的详细表现，并在丛林生态体系的物资轮回和能量勾当中表演侧首要脚色[1-3]。差别泥土散布着差别的泥土微生物，而差别的微生物多样性又影响泥土功效的多样性[4]。泥土微生物的构成和散布可以或许或许或许或许或许或许或许或许在深条理上揭露丛林生态体系的物资轮回和能量勾当。今朝测定泥土微生物多样性的体例首要有浓缩平板法、磷脂脂肪酸阐发（PFLA）法、Biolog微平板阐发法及份子生物学体例等[5]。跟着份子生物学手艺在泥土微生物研讨中的不时成长，泥土微生物多样性的研讨有了新的冲破。核糖体ITS区为非编码区，遭到的挑选压力较小，退化速率快。是以该区段可以或许或许或许或许或许或许或许或许供给比拟丰硕的变异位点和信息位点，今朝已用于种间、亚种和种群程度上的遗传多样性研讨[6]。自从Innis等[7]1990年起首设想ITS引物对真菌核内核糖体RNA基因停止扩增以来，ITS序列阐发手艺在真菌分类、判定的研讨中操纵愈来愈遍及。
该研讨操纵份子生物学手艺对长白山自然掩护区差别丛林范例的泥土真菌群落构成停止阐发，比拟差别植被范例与泥土真菌之间的干系及变更趋向，以期加深对泥土真菌变更进程和机制的熟悉，为长白山地域自然林掩护和生态扶植供给根本资料。
1 资料与体例
1.1 资料
泥土样品于2010年10月采自长白山自然掩护区（表1）。按差别林型接纳对角线型夹杂取样法收罗表层的泥土，收罗深度为0～5 cm，用塑料袋封装带回。-80 ℃下密封保管。
1.2 试剂与仪器
Taq DNA 聚合酶、dNTPs、限定性内切酶Hinf Ⅰ购自宝生物工程（大连）无限公司；泥土真菌基因组提取试剂盒购自MoBio Laboratories公司；DNA纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）无限公司。Gene-9700型PCR扩增仪、上海卢湘仪台式离心计心情、BIO-RAD凝胶成像体系等。
1.3 体例
1.3.1 泥土样品DNA的提取与检测 泥土样品DNA的提取参照MoBio泥土真菌提取试剂盒的体例。
1.3.2 ITS-PCR扩增及产品纯化 用于ITS片断扩增的引物接纳真菌ITS区通用引物ITS1-F和ITS4，由上海生工生物工程手艺办事无限公司分化，详细序列以下：ITS1-F（5′3′）：CTTGGTCATTTAGAGG
AAGTAA；ITS4（5′3′）：TCCTCCGCTTATTGATAGC。
ITS扩增反应体系为：5 μL 10×PCR Buffer（50 mmol/L KCl；10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3；1.5 mmol/L MgCl2）、2 μL DNA模板、ITS1-F和ITS4（10 μmol/L）各2.5 μL、4 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加ddH2O至50 μL。反应前提为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性60 s，52 ℃退火60 s，72 ℃耽误60 s，共35个轮回；最后72 ℃耽误8 min。取5 μL ITS-PCR扩增产品经1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像处置体系察看摄影。
1.3.3 ITS-PCR产品的纯化 接纳DNA纯化试剂盒，按照申明书停止PCR产品纯化。
1.3.4 ITS-PCR产品的限定性酶切阐发 ITS-PCR产品的T-RFLP阐发反应体系为30 μL：含10 μL ITS-PCR产品、2 μL Hinf I（10 U/μL）、3 μL 10× Buffer、加ddH2O至30 μL。置于37 ℃水浴中酶切反应4 h，尔后65 ℃感化20 min停止反应。将酶切产品送至上海美吉生物医药无限公司测序。
1.3.5 数据阐发 每一个T-RFLP的品貌百分比（Ap，%）按照公式Ap=ni/N×100%计较， 此中ni代表每一个可分辩的T-RFLP的峰面积， N代表一切T-RFLP峰面积的总和。种群多样性指数[8]用BIO-DAP软件计较。按照公式Cs=2N（A+B）/（NA+NB）计较样品之间Sorenson[9，10]的近似系数， 此中NA+B指两样品共有的条带数目，NA、NB指两样品各自包罗的条带数目。
2 成果与阐发
2.1 差别丛林范例泥土真菌T-RFLP阐发成果
操纵限定性内切酶Hinf Ⅰ对6种差别丛林范例泥土真菌ITS区停止酶切，T-RFLP阐发成果见图1。从图1可以或许或许或许或许或许或许或许或许看出，酶切谱带清楚，RFLPs比拟较着，酶切片断在100～600 bp之间，差别丛林范例真菌群落存在较着差别。
2.2 差别丛林范例泥土真菌多样性
差别丛林范例泥土真菌香农多样性指数、平均度见表2。由表2可知，1号样点的香农多样性指数最高，3号样点的最低；1、2、3、5号样点的平均度高，4号样点的平均度最低。通俗而言，多样性越高群落不变性大，不变性的巨细反应了多样性的巨细。动物根系可为微生物栖身供给很好的场合，植被笼盖使得泥土湿度更适合于群落的成长，微生物群落的成长反过去又有益于动物群落的成长。
2.3 差别丛林范例泥土真菌近似性
从差别丛林范例泥土真菌群落布局近似性系数阐发成果见表3。因为丛林范例的差别，泥土的真菌群落也有较大差别，群落功效也有较大差别，甚至丛林范例靠近的泥土，真菌的近似性也比拟低，丛林泥土真菌的空间差同性很大。
3 小结与会商
3.1 泥土样品DNA的提取与纯化
若何取得高品德的泥土样品总DNA是份子生物学手艺的根本和关头[11]，只要取得高品德的泥土样品总DNA才能保障后续PCR扩增的精确、靠得住。土样中首要净化物为多糖、腐殖酸和酚类化合物，此中腐殖酸的理化性子与核酸近似，是以在DNA提取进程中很难完整去除，而腐殖酸等杂质会影响后续的PCR反应[12]。
3.2 泥土真菌多样性指数
香农多样性指数是一种评估差别泥土的微生物群落多样性很是有用的体例，香农多样性指数越高标明微生物群落多样性越大，它由品种的丰硕度及品种的平均度两局部构成[13，14]。在差别范例的丛林泥土中，真菌的群落香农多样性指数显现出较大的差同性和庞杂性，这可以或许或许或许或许或许或许或许或许是因为自然丛林中的真菌的空间异质性高而至。白桦林中前期和过熟阔叶红松林，光照充沛， 搅扰少， 泥土布局比拟不变， 枯枝落叶堆集多， 水份修养好， 适合微生物成长， 以是泥土真菌的类群多，泥土绝对较肥饶。从全体下去看， 白桦林中前期和阔叶红松林泥土品德高， 微生物品种多，泥土布局不变，有益于动物的成长。
该研讨对差别丛林范例泥土真菌群落的变更纪律停止研讨， 切磋了真菌群落的演替纪律， 但对真菌群落的变更纪律和微生物与动物之间若何互作还需进一步研讨。同时对其余样点的丛林范例泥土微生物群落的变更纪律若何另有待进一步揭露。
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中图分类号：S154.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2012）23-5253-06
Advances of Total DNA Extraction Technology for Soil Microbial Diversity Research
XIAO Bin，JIANG Dai-hua，LIU Li-long，LIU Quan-dong
（College of Agronomy，Guangxi University，Nanning 530005，China）
Abstract： The influencing factors and application aspects， as well as the potentials and limitations of DNA extraction techniques for microbial diversity analysis were reviewed. Applying appropriate methods to extract microorganism DNA fragment that have right purity and appropriate size from soil were the precondition in soil microbial study on the molecular level， and the subsequent molecular biotechnology operations were all rely on these methods.
Key words： soil microorganism； diversity； DNA； extraction method
泥土微生物多样性是生物多样性研讨的一个首要范畴，是指其在遗传、品种、布局与生态功效方面的变更，对唆使泥土微生物群落的不变性，在对峙泥土品德和生态体系不变性等方面具备首要意思[1]，是现今国际外存眷和研讨的热点题目之一。
耐久以来，因为研讨体例的限定，传统的分手纯化培育手艺仅能取得泥土中微生物总种群数的1%摆布，而绝大局部微生物今朝还不能取得纯培育[2]，未能取得纯培育的微生物才是泥土微生物的主体，是以，有关微生物多样性研讨停顿不大。
比来几年来，跟着份子生物学手艺的成长和研讨手腕的更新，基于泥土微生物群落总DNA的古代微生物份子生态学研讨体例防止了传统分手培育体例的错误谬误，被遍及操纵于泥土微生物群落布局、功效和静态监测研讨[3]。是以作为微生物群落份子阐发体例的根本，最首要的一步便是从泥土样品中尽可以或许或许或许或许或许或许毫无偏差地提取出高品德的、具备代表性的微生物总基因组DNA。对泥土微生物DNA提取体例的报道良多[4，5]，可是这些体例首要偏重于泥土中的细菌群落，很少存眷泥土中真菌群落总基因组DNA的提取体例及其提取成果。别的，细胞裂解不完整、DNA份子吸附在样品基质颗粒的外表、从样品中同时提取了某些首要酶的活性按捺剂、DNA份子的消耗、降解和粉碎等身分也影响着泥土微生物DNA提取的品德，是以提取泥土微生物总DNA在研讨中出格首要[6]。本文首要对DNA提取进程中的首要影响身分、现行各体例的优错误谬误和存在的题目作一综述。
1 基于DNA体例的泥土微生物多样性研讨近况
传统微生物学研讨体例首要依靠于纯培育手艺和显微镜手艺，对泥土微生物多样性的描写与研讨存在必然的规模性。20世纪中前期，跟着泥土微生物多样性研讨向多方面成长，人们测验考试着操纵阐发微生物细胞中某种唆使成份，如磷脂脂肪酸（PLFA）来研讨泥土微生物的种群构成，可是这些体例的错误谬误是没法保障细胞中某种唆使成份在泥土中的不变性，并且若是某种微生物的PLFA是未知的，则该不可培育微生物仍难以辨别[7，8]。
1980年，Torsvik等[9]初次成立了从泥土样品中间接提取细菌DNA的体例，并于1990年将其胜利操纵于DNA杂交手艺，研讨发明1 g泥土中有4 000个以上差别的细菌品种，申明泥土中微生物多样性是极为丰硕的。厥后研讨者发明16S rDNA在原核微生物中遍及存在，并且含有绝对激进和可变地域，在差别的个别间16S rDNA基因序列也不会停止基因互换，是以，每种生物都有本身的怪异序列。1986年，Pace[3]第一次以16S rDNA为根本肯定情况样品中的微生物，令人们对大批不可培育微生物群体有了全新的熟悉。尔后，基于16S rDNA基因的指纹图谱阐发的古代份子生物学手艺取得敏捷成长，包含限定性片断长度多态性阐发（RFLP）、随机扩增DNA多态性阐发（RAPD）、单链构象多态性阐发（SSCP）、基因芯片（Microarray）、PCR-DGGE/TGGE 等，为周全揭露泥土微生物种群布局和遗传多样性供给了首要手腕。其总的手艺线路：分手微生物基因组DNA，用特同性引物扩增16S rRNA基因片断，再将该PCR扩增产品停止更深一步阐发，从而可在种、属的程度上研讨差别生境中的微生物种群布局及其静态变更[10]。
2 泥土微生物总DNA的提取
从泥土样品中提取DNA的体例大抵可分为2类，即间接提取法和间接提取法。间接提取法起首是对泥土样品停止频频悬浮和离心，去除泥土等杂质，提取泥土微生物细胞，再接纳酶裂解细胞提取微生物总DNA。间接裂解法是不去除泥土等杂质，而是经由进程物理的、化学的、酶解等手腕相连系，间接裂解泥土中的微生物细胞，使其开释DNA，再停止提取和纯化。但不管接纳何种体例，都存在必然的错误谬误，要想提取较完整的DNA须要具备以下几个前提： ①泥土微生物能从泥土中充实开释，出格是那些牢牢吸附在泥土颗粒，甚至深藏于泥土微穴中的细菌等绝对比拟难分手的微生物。②对一些比拟固执的微生物，如革兰氏阳性菌、孢子和小细菌的裂解，须要更猛烈的处置，而这又会构成对裂解敏感的细菌DNA折断。③收罗泥土样品后应尽快提取DNA，因为泥土在4 ℃储藏几周就会构成大份子DNA的降解。
2.1 间接提取泥土微生物总DNA
Torsvik等[11]最早报道了从泥土中提取微生物DNA的间接法，包含以下4个步骤：①分手泥土；②泥土微生物的提取（分手细胞与泥土）；③泥土微生物的纯化；④细胞裂解及DNA纯化。
2.1.1 泥土分手 泥土微生物通俗与泥土颗粒连系，包藏在泥土团圆体内，是以，最大限定地分手泥土是从泥土平分手提取微生物的关头。凡是接纳物理或化学法，或是二者相连系以到达微生物与土粒分手的目标。常常操纵的物理分手手艺是操纵玻璃珠与泥土悬液一路振荡，或是操纵韦林氏搅拌器（匀浆器、转子夹杂器）搅拌分手，或是操纵超声波分手泥土团圆体等。而化学分手法是经由进程插手化学分手剂以到达增进微生物与土粒分手的目标。最常常操纵的分手剂为0.2%焦磷酸钠，其余另有Winogradsky盐溶液、Tris缓冲液、心理盐水、六偏磷酸钠、胆酸钠、脱氧胆酸钠、纯水等[26]。值得重视的是，为有用地分手泥土，分手剂的品种、浓度、插手量、机器感化（振荡、搅拌和超声波等）的体例、时候和容器的巨细等均应加以斟酌。还可以或许或许或许或许或许或许或许或许将化学试剂与机器体例连系来悬浮泥土颗粒。研讨发明Chelex100便是一种有用的泥土颗粒悬浮剂。各类分手体例分手成果差别，接纳何种分手体例成果最好今朝还不分歧论断，并且防止细胞因物理、化学感化致使分裂提早开释DNA很首要，处置不妥会使DNA降解。常常操纵分手提取泥土微生物的泥土分手体例到场表1。
2.1.2 泥土微生物的提取 泥土微生物的提取凡是接纳离心分手法，既要使微生物与泥土颗粒分手，又要保障根基不粉碎微生物细胞。因为泥土中细菌的平均密度（1.1 μg/cm3）远小于泥土矿物资的平均密度（2.6 μg/cm3），是以接纳离心或淘选法可以或许或许或许或许或许或许使细菌与泥土颗粒取得较好的分手。Hopkins等[17]接纳密度逐级离心法分手出60%以上的泥土细菌。别的，也有学者提出用过滤法，行将泥土样品分手处置后，经20 μm或30 μm微孔筛真空抽滤，其滤液中即可以或许或许或许或许或许或许或许或许含有绝大大都泥土细菌，此进程操纵简洁，提取液中泥土残留物少，易于纯化。
因为泥土中的真菌、放线菌首要以菌丝的形状与泥土颗粒环绕纠缠在一路和细胞壁布局的出格性，从泥土样品平分手提取真菌放线菌要比提取单细胞的细菌绝对坚苦。迄今为止，国际外有关分手提取真菌的研讨文献少少，且这些报道体例所提取的真菌菌丝只占真菌总生物量的少少局部。Vilarino等[21]在后人研讨的根本上提出了分手泥土真菌的道理：新奇泥土经分手后，泥土悬浮液中的菌丝可附着在慢速动弹的铜丝（直径150 μm）框上，洗脱后即得提取的泥土真菌。潘力等[22]以曲霉菌为例，接纳微波处置菌丝并置于10× TE Buffer中便可取得DNA，成立了一种疾速提取丝状真菌DNA的测验考试体例，为高通量疾速挑选丝状真菌转化子奠基了根本。吴敏娜等[23]以传统泥土总DNA提取体例及纯菌DNA提取体例为根本，别离与蜗牛酶、纤维素酶停止组合、优化，取得7种差别的泥土真菌基因组DNA提取体例。分手提取泥土细菌和真菌的流程如图1所示。
2.1.3 泥土微生物的纯化 今朝常常操纵两相分手手艺对上述泥土微生物提取液停止纯化。两相分手手艺最早为德国化学家Albertsson于20世纪50年月所成立，那时首要用于生物大份子的分手。最近几年该手艺遍及操纵于生归天学、细胞生物学和生物工程等范畴，是一种分手、纯化生物大份子、细胞、病毒的体例，该手艺也慢慢成长成为一种暖和的生物分手体例，绝对原始的纯化手腕具备进程简略、纯化时候较短等特色，操纵范畴遍及[24]。对其分手机制今朝尚不完整清楚，有人以为其分手的道理首要取决于差别组分的亲水性差别，也有人以为还与差别组分的电荷性子差别有关。当两种互不相溶的聚合物以必然浓度溶于水中时，便可构成体积差别的两相，被分手组分因为其与两相的亲和力差别，别离进入差别相从而到达分手的目标。今朝操纵最为遍及的是PEG（聚乙二醇）/Dextran（葡聚糖）体系和PEG/无机盐（磷酸盐或硫酸盐）体系。对差别的两相组分，分手时候不尽不异[25]。Smith等[19]研讨了操纵两相分手手艺从泥土平分手纯化非菌丝体微生物的成果，发明经充实夹杂静置必然时候后，便可构成凹凸两层体积比约为4∶1的两相分手体系，此中细菌首要富集在基层PEG相，泥土残存颗粒将进入基层Dextran相，经4次提取纯化，富集在基层PEG相的细菌总量约达插手两相分手体系细菌总量的60%，而基层PEG相中的泥土矿质颗粒总量仅占总插手量的4%以下。李妍等[26]用2%PEG+6%Dextran两相分手手艺（A2PP）纯化细菌，测定细菌生物量，研讨两相分手手艺在泥土微生物研讨范畴的可操纵性，成果标明接纳0.1%胆酸钠、钠型离子互换树脂、玻璃珠与泥土一路在4 ℃下振荡2 h，能较好地分手、纯化泥土细菌。研讨标明，两相分手手艺一样有可以或许或许或许或许或许或许或许或许用于分手纯化泥土真菌。
2.2 间接提取泥土微生物总DNA
现今的泥土细菌DNA间接提取法是在Ogram等[27]成立的体例根本上成长起来的，首要包含两个步骤：①原位细胞裂解；②DNA提取和纯化。
2.2.1 原位细胞裂解 间接裂解泥土微生物细胞的体例包含：机器破裂法、化学法、酶解法及3种手腕相连系。机器破裂法常常操纵的有冻融法、微波、超声波法和玻璃微珠震动法；化学法常常操纵外表活性剂SDS和SarkosyI、热酚、高盐、异硫氰酸胍等；酶解法：裂解酶、溶菌酶、卵白酶K、链霉卵白酶等。此中溶菌酶不只可处置革兰氏阳性菌细胞壁，还可水解糖苷键和腐殖酸。2种或多种体例相连系对DNA的提取成果较好。王啸波等[28]接纳PBS缓冲液洗濯泥土样品，连系SDS裂解微生物细胞的体例，同时提取2种泥土样品的微生物DNA和RNA，成果标明该法提取的核酸不须要进一步处置，其纯度便可以或许或许或许或许或许或许或许或许知足后续的份子生物学测验考试，从而防止了因为纯化致使的核酸量的降落。熊开容等[29]接纳冻融+玻璃珠+溶菌酶+SDS体例提取了活性污泥中微生物DNA，成果标明取得的DNA适合于酶解和PCR扩增请求。
值得存眷的是，泥土中微生物品种单一，心理状态差别，革兰氏阳性和阳性细菌和细菌与真菌的细胞壁布局和构成亦不不异。为了使提取的DNA具备代表性，就必须保障泥土样品中一切微生物细胞裂解开释出核酸，是以必须按照测验考试的性子、请求挑选恰当裂解体例。研讨标明，基于SDS的高盐提取法会对一些革兰氏阳性细菌成果不好。张瑞福等[30]接纳冻融+溶菌酶+SDS体例提取3种芽孢杆菌（G+）DNA，成果标明经冻融处置的霉状芽孢杆菌均提取到了DNA，未经冻融处置的霉状芽孢杆菌未提取到DNA，且冻融处置未对DNA构成大的剪切，提取的DN段还大于23.1 kb。张颖悟等[31]操纵优化的CTAB法提取真菌基因组DNA。操纵液氮冻融和玻璃珠振荡的体例取代了传统的液氮研磨，测验考试成果标明该体例所需菌体量少，且取得的基因组DNA比用传统的CTAB法取得的基因组DNA产率高、纯度好且步骤简略，合用于一次微量提取多个样品的基因组DNA，可用于大局局部子生物学根基测验考试如PCR和DNA的酶切等。
2.2.2 DNA提取和纯化 在已报道的DNA提取和纯化体例中，凡是接纳饱和酚或氯仿和卵白酶处置，去除DNA样品中的卵白质和局部RNA，尔后对DNA停止抽提，再用乙醇、异丙醇或聚乙二醇（PEG）积淀后，经羟基磷灰石柱或氯化铯密度梯度超速离心等进一步纯化。其余纯化体例有聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）法、色谱法、电泳法、透析和过滤法、试剂盒法等。
Lamontagne等[32]研讨成果标明PVP可以或许或许或许或许或许或许或许或许与腐殖酸连系，起到有用去除提取的DNA中腐殖酸杂质、前进DNA纯度的感化。李靖宇等[33]接纳氯化钙-SDS-酶法对湿地泥土微生物DNA停止提取，成果标明该体例能高效去除湿地泥土腐殖酸，纯度较高，能间接知足PCR扩增。李钧敏等[34]用含PVPP的缓冲液预洗DNA样品，尔后增添CaCl2和牛血洁白卵白可去除此中的腐殖酸，用PEG8000积淀DNA，可前进DNA品德，并证明这是一种简洁有用可间接操纵于PCR阐发的泥土微生物总DNA的提取体例。蔡刘体等[35]接纳 SDS-CTAB法提取烟草病圃泥土微生物总DNA，该体例既可到达裂解成果，另有助于去除腐殖酸，有益于前进所提取DNA 的品德。吴红萍等[36]接纳酚氯仿和柱式腐殖酸去除剂对粗提取的泥土微生物DNA停止纯化后，可用于PCR扩增，并以细菌16S rDNA基因引物可扩增到呼应的片断。朱立成等[37]接纳间接法提取泥土微生物总DNA，尔后用Sephadex G-200凝胶离心层析法纯化，可取得纯度较高的DNA。段学军等[38]接纳浓缩模板及巢式PCR法很好地处置了在DNA提取纯化进程中不能完整去除腐殖质的题目。滕应等[39]将BIO101 Systems公司研制的FastPrep多试管核酸提取体系与呼应的Fast DNA SPINKit for Soil试剂盒联用，有用地提取了重金属复合净化的农田泥土微生物总DNA。
不哪一种单一的纯化步骤可以或许或许或许或许或许或许或许或许撤除一切净化物，故良多研讨者已将几种纯化步骤连系起来以期取得最好的纯化成果。Smalla等[40]将粗提的DNA停止3步纯化：①氯化铯密度梯度超速离心纯化；②醋酸钾积淀；③Geneclean纯化。发明经前2步纯化的DNA经由进程浓缩便可局部被限定性酶切和扩增，但如不经浓缩而停止限定酶切和扩增，则必需停止最后一步纯化。
2.2.3 间接法和间接法的比拟 研讨标明，间接法取得的DNA较多，但不易去除按捺剂，间接法提取的DNA只占间接法的1/10，但分手的DNA纯度较高，并且间接法取得的细菌量只占总菌群的25%～50%，间接法提得的DNA却可以或许或许或许或许或许或许或许或许跨越细菌总DNA的60%。是以，要想取得大批DNA，挑选间接法较好，当所需DNA量不大，并且要消除真核或胞外DNA净化时，可用间接提取法。
间接提取对某些特定样品用特定的操纵体例能取得较高的提取效力，可是对有些生物量不高的样品则很难取得充沛的情况总DNA用于后续操纵，适合在样品生物量较大但采样量不大的情况下接纳。间接提取在提取效力上远小于间接提取，但用间接提取法所取得的情况总DNA纯度较高，一切样品能间接用于PCR扩增，并且能更好地表现样品中微生物的多样性，合用于有大批样品的情况。
2.3 DNA的纯度和浓度测定
DNA在260 nm处有接收峰，腐殖酸在230 nm处有接收峰，计较OD230/OD260（腐殖酸/DNA）的比值可以或许或许或许或许或许或许或许或许肯定所提DNA中腐殖酸的净化程度。通俗情况下OD230/OD260比值应在0.4～0.5之间为好， OD230/OD260比值越高，腐殖酸净化越严峻。卵白质在280 nm处有接收峰，是以OD260/OD280比值常常被用来唆使DNA中卵白质的净化程度，当OD260/OD280比值为1.8～2.2时，DNA较纯，当受卵白质或其余杂质净化时，OD260/OD280值则较低[41]。别的，还可接纳PCR扩增检测DNA的纯化品德，所用扩增引物见文献[42]。
提取的DNA浓度也可按照测定的OD260值计较，按照公式[dsDNA]=50×OD260×浓缩倍数，计较DNA的浓度（μg/mL），换算出每克干土提取DNA的量[43]；还可接纳DyNA Quant 200荧光仪对纯化后DNA的浓度停止测定[28]。
3 影响泥土微生物总DNA提取的因子
泥土成份庞杂，含有大批的无机及无机等多种生物活性按捺物，如腐殖酸、多酚类化合物、重金属等，它们的存在可以或许或许或许或许或许或许或许或许影响泥土DNA的提取品德，按捺DNA聚合酶的活性从而影响泥土微生物多样性的阐发。研讨发明，腐殖酸是泥土DNA提取进程中极难去除的净化物，因为它的份子巨细和理化性子与DNA近似，过度重视腐殖酸的去除，必将会构成DNA的大批丧失，是以腐殖酸的有用去除是泥土DNA提取的难点地点。
各类泥土范例、质地和成份的差别，都会影响泥土微生物DNA的提取成果。Zhou等[44]用SDS-CTAB法从8种泥土（包含膏壤、沙膏壤和沙黏土，此中黏土含量为5%～31%不等）中提取DNA，平均取得DNA的量为0.5～26.9 μg/g，并发明取得的DNA量与泥土的无机磷含量有较着的正相干干系。别的，研讨也发明，泥土中细菌的裂解效力与此中黏粒的含量呈较着的负相干。泥土中各粒级颗粒对细菌的吸附量从大到小的挨次为：黏粒、粉粒、细沙粒、粗沙粒，此中黏粒是粉粒的3.7～4.9倍、细沙粒的44.3～89.2倍、粗沙粒的262.0～799.0倍，细菌在粒径差别的泥土颗粒外表的最大与最小吸附量别离相差389.0和857.0倍，去无机质泥土颗粒对细菌吸附亲和力较含无机质泥土颗粒的大[45]。是以，差别的泥土适合于差别的DNA提取体例，在泥土DNA提取进程中，应针对泥土种别拔取适合的提取体例，以便停止后续研讨。
4 小结
从泥土微生物群体基因组的角度研讨其多样性及功效是可行的体例，并遭到遍及的存眷[46]。是以超越度手培育的步骤，间接从泥土中取得总DNA以阐发泥土微生态群落布局，关头是若何尽可以或许或许或许或许或许或许或许或许周全地提取泥土中微生物的总DNA。泥土本身成份庞杂，有良多物资难以预感，对提取较好品德的DNA提出了很高的请求。是以成立一种简略有用的提取体例显得很是首要。
间接法提取的微生物DNA纯度较高，提取的品种和数目较少；间接提取法间接在泥土中裂解细胞，使此中内含物尽可以或许或许或许或许或许或许或许或许地开释，可以或许或许或许或许或许或许或许或许代表大局部的泥土微生物，但泥土中所含物资品种较庞杂，以是提取的DNA品德遭到很大的影响，须要进一步纯化，而这些处置常常构成局部DNA的丧失，可以或许或许或许或许或许或许或许或许使在泥土中本身存在量较少的品种丧失或检测不到，影响到泥土微生物多样性的阐发。比来，Milko等[47]发明一种Taq DNA聚合酶基因渐变型可增添对腐殖酸等PCR按捺物的抗性，不须要对基因组DNA停止纯化便可以或许或许或许或许或许或许或许或许停止后续的份子生物学阐发，是以具备遍及的操纵远景。
绝大大都间接提取法提取的DN段长度不会跨越23 kb，而DNA的某些用处如宏基因组文库构建，须要大片断的DNA，间接提取法对此几近能干为力。
在DNA提取产率高即表现其所代表的微生物多样性高的前提下，DNA间接提取法被以为是较好的体例并被遍及操纵[48]。但比来几年来有研讨标明DNA提取的产率高差别即是微生物的多样性高，间接提取法又再次被提出并用于相干研讨[49]。这就请求在挑选提取体例时不只要试用间接提取和间接提取这两类体例，并且在每类体例中也要试用差别的处置组合体例，以使后续操纵能顺遂停止，并取得精确可托的研讨成果。
评估一种泥土微生物DNA提取体例是不是有用，除凡是请求的提取片断无降解且比拟完整外，还须要可以或许或许或许或许或许或许或许或许有用去除泥土中大批存在的影响后续测验考试的物资，如腐殖酸、腐殖酸似物、酚类化合物、重金属离子等；能在单元样本量中比拟完整地提取出微生物DNA；提取体例应具备普适性，对泥土中大大都微生物可以或许或许或许或许或许或许或许或许有用等[50]，且提取的DNA能更好地代表泥土微生物的实在性和异质性。
5 瞻望
今朝，国际外对泥土微生物总DNA提取体例的报道良多，但每种体例都存在必然的错误谬误。是以，从泥土样品中提取DNA还不通用的最好打算，须要按照详细的泥土特色、测验考试室前提和测验考试目标而定。在提取进程中还要统筹测验考试操纵是不是简洁，体例是不是经济和样品量是不是充沛。别的，将古代份子生物学手艺与传统微生物研讨体例连系起来，才能更周全地熟悉和懂得泥土微生物群落多样性及其呼应的生态功效。
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关头词:污水办理;水源掩护;生态学阐发
Key words: sewage treatment;water conservation;ecological analysis
中图分类号:TU992文献标识码:A文章编号:1006-4311(2010)15-0170-01
0弁言
水是人类社会出产和糊口必不可少的可贵自然资本,也是生物赖以保管的情况资本。财产反动以来,跟着科技前进和社会出产力的极大前进,人类缔造出史无前例的物资财产,加速推动了文化成长的进程。与此同时,人类的出产糊口勾当发生的净化也构成了水情况品德不时好转和水资本危急的加重,水情况净化与水资本欠缺已演变成备受全天下存眷的资本情况题目,严峻地障碍着经济的成长和国民糊口品德的前进,继而要挟着人类的将来保管和成长。
1我国污水办理的手艺情况
在污水办理设备方面,全体手艺也掉队于国际前进前辈程度,仅为国际20世纪70-80年月的程度。这些污水办理设备仅仅可以或许或许或许或许或许或许或许或许知足通俗财产废水和糊口污水的处置须要。因为处置设备单机产品多,系列化程度低,成套装配出产缺少,严峻缺少出产高新生物手艺处置设备的才能。我国出产的用于都会污水办理的能源设备,如鼓风机、水泵等,遍及存在能耗较大的题目,构成我国都会污水办理举措措施的经营用度居高不下,在必然程度上也限制了我国都会污水办理财产的成长。[1]
2我国的污水办理手艺
2.1 厌氧生物处置手艺厌氧生物处置手艺的能耗较低,可以或许或许或许或许或许或许或许或许收受接管生物能(如:沼气),污泥产量较低。厌氧微生物可以或许或许或许或许或许或许或许或许对好氧微生物所不能降解的无机物停止降解或局部降解;对温度、pH等情况身分请求较高。但全体来讲,经厌氧生物处置的出水,水质较差,须要进一步操纵好氧法停止处置,陪同气息较大,对氨氮的去除成果不抱负。
2.2 好氧生物处置手艺常常操纵的好氧生物处置工艺有三大类:活性污泥法、生物膜法、膜生物反应器工艺。
①活性污泥法工艺。活性污泥法首要包含传统性污泥法污水处置手艺、氧化沟手艺、间歇式活性污泥处置手艺(SBR,Sequencing Batch Reactor)和AB法污水处置手艺。SBR法的工艺流程简略,且造价低,主体设备只要序批式间歇反应器,无需二沉池和污泥回流体系,初沉池也可省略。具备安排松散,占空中积小的特色,可按照水质和水量情况矫捷运转,具备杰出的脱氮除磷成果。[2]②生物膜法工艺。污水的生物膜处置手艺既是传统的,又是成长中的污水生物处置手艺。迄今为止,属于生物膜处置法的工艺有生物滤池(通俗生物滤池、高负荷生物滤池、塔式生物滤池)、生物转盘、生物流化床、曝气生物滤池(BAF)、生物打仗氧化、纯氧生化处置等。生物滤池是早期显现、至今仍在研讨、成长中的污水生物处置手艺,尔后三种则是近几十年来开辟的新工艺。③膜生物反应器工艺。膜生物反应器MBR是二十世纪未成长起来的新手艺,它是膜分手手艺和活性污泥生物手艺的连系。它差别于活性污泥法,不操纵积淀池停止固液分手,而是操纵中空纤维膜替代积淀池,是以具备高效固液分手机能,同时操纵膜的特色,使活性污泥不随出水散失,在生化池中构成超高浓度的活性污泥浓度,使净化物分化完整,是以出水水质杰出、不变,出水细菌、悬浮物和浊度靠近于零。糊口污水处置后可间接回用,在污水处置方面具备传统工艺所不具备的长处。
2.3 污水的自然处置手艺污水的自然生物处置体例首要是操纵自然的生态体系如地盘、湿地等,经由进程生态体系中的动物、动物与微生物协同感化,去除污水中净化物的一种体例。我国在“七五”时代就已对废水地盘处置手艺停止了遍及的研讨,处置了良多手艺上的题目,“八五”时代又到场了国度攻关重点名目,这也为我国推行操纵地盘处置体系缔造了前提。[3]
3PLFA体例阐发曝气生物滤池微生物的研讨
3.1 PLFA体例在水体微生物群落布局和生物多样性阐发中操纵在现有的对水中微生物群落的研讨中,PLFA通俗只能定性的、大略的区分革兰氏阳性、阳性、好氧细菌、厌氧细菌、放线菌、真菌等,很少能用来定性的丈量指定种属的微生物。今朝,只要大都几种PLFA生物标记物可以或许或许或许或许或许或许或许或许唆使某些种属的细菌,如硫酸盐复原细菌等。公开水华夏生动物的PLFA标记物的发明有助于领会深层含水层中微生物食物链布局和微生物的活性,在公开水的微生物修复方面具备首要意思。[4]
3.2 PLFA体例在堆积物微生物群落布局和生物多样性阐发中操纵江、海等堆积物的微生物区是由庞杂的微生物群落构成,它可以或许或许或许或许或许或许或许或许实现首要的矿化反应,这对营养元素的轮回和大局部深海食物链的构成具备首要感化。操纵PLFA谱图阐发体例可以或许或许或许或许或许或许或许或许取得有关堆积物中微生物生物量和群落布局的信息,堆积物样品可以或许或许或许或许或许或许或许或许不停止处置,也可以或许或许或许或许或许或许或许或许是冷冻或冻干的。PLFA法在堆积物微生物群落布局和生物多样性阐发中的操纵,对污水办理手艺的前进有侧首要的实际意思。
4结语
水是人类赖以保管的三大性命身分之一。在我国,颠末几十年的鼎新开放,经济取得了迅猛成长,同时也带来了诸多情况题目,出格是水净化很是凸起,严峻限制着社会经济和情况的可延续成长。跟着我国财产、农业的敏捷成长和人们糊口程度的前进,水体净化景象愈来愈严峻,间接要挟着人类的性命安康和全数生态体系的不变性。严峻的水情势火急请求咱们必须鼎力停止污水处置及其资本化,同时因为我国经济程度尚不发财,更火急须要咱们研讨、推行和操纵处置高效、投资节流、运转低耗的污水处置新手艺。
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记者：请您为咱们先容一下深海生态体系查询拜访研讨的意思与静态情况。
邵宗泽：深海水体、深海堆积物、深海平原、海山、海沟、冷泉等各类生境构成了深海出格的生态体系。深海生态体系是地球上最大的生态体系，庞杂怪异、生境多样，储藏着庞大的基因资本，已引发国际社会高度存眷。
与地球上其余生态体系比拟，对深海生态体系的查询拜访研讨还很少。固然早在1977年，美国“阿尔文”号深潜器就发明了深海热液区，但今朝对深海热液生态体系的熟悉还比拟浮浅。差别地质背景的热液成份及生物群落构成具备怪异点，今朝对各大洋的热液生态体系的散布与生物种群特色还不周全的领会。对古菌、细菌和噬菌体等在深海生态体系的构成与保持进程中的感化，另有良多题目期待解答，热液勾当在地球性命发源中的感化还是一个谜。
记者：深海微生物是深海生态体系的首要成员，请您先容一下国际上深海微生物查询拜访研讨的情况。
邵宗泽：微生物是深海生态体系中的首要构成局部，与其余陆地生物构成了紧密亲密的共附生干系。深海极度高温、高温、有氧、无氧等各类百般的情况前提挑选出了多种多样的微生物。营养窘蹙的大洋情况培育了寡营养的陆地微生物，寡营养微生物以其精简的基因组和出格的代谢机制顺应了出格的深海情况。总的来讲，各类古菌、细菌、噬菌体遍及散布于全数陆地情况，构成了怪异的“深部生物圈”，它们在地球生归天学轮回中起侧首要感化。
此中，深海化能自养微生物对热液及海底冷泉生态体系的构成相称首要。用时8年的化能自摄生态体系打算（ChEss project）对南大泰西、南承平洋等四个海区的深海化能自摄生态体系停止了查询拜访。在位于南承平洋开曼海槽（Cayman trough）的超慢速扩大洋中脊，发明了水深最深热液口（6800米），生态情况唯一无二；在南大泰西中脊发明了最热的热液口，还在新西兰四周发明了庞大的深海冷泉区，在北极的摩恩（Mohns Ridge）发明了大批的硫氧化菌席。
深海堆积物也是一个庞大的、自然的DNA资本库，仅位于深海堆积物顶部的10厘米空间，据预算约含有4.5亿吨脱氧核糖核酸（DNA）。已证明，海底1626米以下的堆积物中也有微生物勾当。深海中储藏着地球上最为丰硕的物种多样性和最大的生物量，被公认是将来首要的基因资本来历地，具备庞大的操纵开辟潜力。
跟着情况基因组、宏卵白组等组学阐发手艺的前进，对陆地微生物的熟悉取得了严峻停顿。美国克雷格?文特尔研讨小组展开的陆地微生物情况基因组系列查询拜访发明，仅在表层海水就有大批的微生物新物种、新基因、新卵白、新路子。这些微生物新物种、新卵白家属、新代谢进程的迷信代价、情况感化和资本代价今朝难以估量。
记者：今朝，深海生物基因资本已成为列国在国际海底竞比拟赛的计谋资本，能不能先容一下国际社会的观点与立场？
邵宗泽：人类对陆地生物基因资本常识产权的具备量每一年在以12%的速率疾速增添，今朝有跨越18000个自然产品和4900个专利与陆地生物基因有关，申明它不再只是个操纵远景，而是一类实际的可贸易操纵的首要生物资本。基因组测序手艺与生物信息手艺的成长，大大加速了陆地微生物基因资本的发明与挖掘速率。
今朝，公海陆地生物基因资本的掩护与可延续操纵，和常识产权归属已成为连系国国际海底集会的首要议题。从2004年起，连系国会员大会成立了“国度统领之外海疆的陆地生物多样性任务组”，每两年召开正式集会商量，我国每次由交际、办理职员和学术专家应邀组团到场，今朝还不被国际社会遍及接管的法令框架来掩护和标准陆地生物基因资本的开辟。
发财国度与成长中国度因各自的经济气力、深海查询拜访才能的差别，对海底遗传资本生物勘察所持的立场也不分歧。发财国度对峙先入为主、自在采探，主意常识产权的掩护。相反，成长中国度主意“人类配合遗产”准绳，对峙好处同享，不撑持公海陆地生物基因资本常识产权的请求掩护。
记者：我国比来几年来在我国大洋深海生物基因资本勘察方面的研讨停顿与近况若何？
邵宗泽：我国在“十五”时代就启动了深海生物及其基因资本的相干研讨，并依靠国度陆地局第三陆地研讨所成立了中国大洋生物基因研发基地。在深海微生物研讨设备的研制、深海微生物根本迷信研讨和资本开辟操纵方面取得了首要停顿。从2003年起，开端成立了我国第一个深海微生物资本库。2005年起，在国度自然科技资本同享平台的撑持下，在深海微生物资本库的根本上成立了中国陆地微生物菌种收藏办理中间。颠末六年堆集，分手了大批新的大洋微生物资本，并经由进程资本的标准化、标准化清算，成立了资本同享平台。
“十一五”时代，在大洋协会洋中脊名目撑持下，颁发深海微生物研会商文200多篇，此中147篇SCI文章颁发在美国迷信院院刊等首要学术刊物上。在极度微生物资本取得、极度酶研讨、活性物资挑选和微生物多样性阐发等方面取得了首要停顿，开端构成了集大洋生物基因资本勘察及大洋迷信研讨于一体的优异团队。
“十二五”时代，在深海生物查询拜访手艺才能、深海（微）生物勘察与资本潜力评估和微生物资本开辟方面，已取得了在科技部、陆地局、大洋协会等各 类名目鼎力撑持，无望取得更大的停顿。
2.1990-2010年中国地盘操纵变更对生物多样性掩护重点地域的扰动
3.青藏高原高寒草甸动物群落生物量对氮、磷增添的呼应
4.新疆连作棉田施用生物炭对泥土营养及微生物群落多样性的影响
5.荒凉草地4种灌木生物量分派特色
6.旱地泥土施用生物炭削减泥土氮丧失及前进氮素操纵率
7.生物肥局部替代化肥对花椰菜产量、品德、光合特色及肥料操纵率的影响
8.差别秸秆生物炭对红壤性水稻土营养及微生物群落布局的影响
9.生物炭对泥土生境及动物成长影响的研讨停顿
10.沙质草地差别糊口史动物的生物量分派对氮素和水份增添的呼应
11.大兴安岭5种典范林型丛林生物碳储量
12.水稻秸秆生物炭对耕地泥土无机碳及其CO_2开释的影响
13.泥土重金属钝化修复剂生物炭对镉的吸附特色研讨
14.生物炭对差别泥土化学性子、小麦和糜子产量的影响
15.生物炭施用对矿区净化农田泥土上油菜成长和重金属富集的影响
16.准噶尔荒凉6品种短寿动物生物量分派与异速成长干系
17.生物炭对泥土中微生物群落布局及其生物地球化学功效的影响
18.生物炭对水中五氯酚的吸附机能研讨
19.生物炭和无机肥处置对平邑甜茶根系和泥土微生物群落功效多样性的影响
20.生物炭对旱作农田泥土理化性子及作物产量的影响
21.中国南边3种首要野生林生物量和出产力的静态变更
22.南海北部边缘盆地生物气/亚生物气资本与自然气水合物成矿成藏
23.基于多源遥感数据的草地生物量预算体例
24.生物炭对农田泥土微生物生态的影响研讨停顿
25.生物炭对泥土理化性子影响的研讨停顿
26.生物扰动对堆积物中净化物情况步履的影响研讨停顿
27.生物炭与秸秆增添对砂姜黑土团圆体构成和无机碳散布的影响
28.近十年中国生物入侵研讨停顿
29.荒凉灌木生物量多标准估测——以梭梭为例
30.泥土无机净化物生物修复手艺研讨停顿
31.生物医学大数据的近况与瞻望
32.黑河中游荒凉草地地上和公开生物量的分派款式
33.生物大灭尽研讨三十年
34.差别热解温度生物炭对Cd(Ⅱ)的吸附特色
35.农用生物炭研讨停顿与远景
36.生物炭对水稻根系形状与心理特色及产量的影响
37.施用生物炭对旱作农田泥土无机碳、氮及其组分的影响
38.差别生物资来历和热解温度前提下制备的生物炭对菲的吸附步履
39.都会生物多样性散布款式研讨停顿
40.生物炭的泥土情况效应及其机制研讨
41.辽河源差别龄组油松自然次生林生物量及空间分派特色
42.稻壳基生物炭对生菜Cd接收及泥土营养的影响
43.小兴安岭7种典范林型林分生物量碳密度与固碳才能
44.西南林区4个自然针叶树种单木生物量模子偏差布局及可加性模子
45.指数施肥对楸树无性系生物量分派和根系形状的影响
46.牛粪生物炭对水中氨氮的吸附特色
47.黄土丘陵区生物结皮对泥土物理属性的影响
48.半干旱沙地生境变更对动物地上生物量及其碳、氮储量的影响
49.青藏高原东缘野生暗紫贝母生物量分派款式对平地生态情况的顺应
50.长江口及东海春季底栖硅藻、原生动物和小型底栖生物的生态特色
51.环球生物多样性评估体例及研讨停顿
52.中国生物多样性当场掩护的研讨与实际
53.温度与降水协同感化对短花针茅生物量及其分派的影响
54.情况品德评估中的生物唆使与生物监测
55.泥土生物多样性研讨:汗青、近况与挑衅
56.转录因子对木质素生物分化调控的研讨停顿
57.太赫兹迷信手艺在生物医学中的操纵研讨
58.玉米秸秆生物炭对Cd2+的吸附特色及影响身分
59.中国食粮作物秸秆燃烧排碳量及转化生物炭固碳量的预算
60.生物炭对我国南边红壤和黄棕壤理化性子的影响
61.黑龙江省大兴安岭丛林生物量空间款式及其影响身分
62.差别生物资质料水热生物炭特色的研讨
63.凤眼莲、稻草和污泥制备生物炭的特色表征与情况影响剖析
64.西南地域两个首要树种地上生物量通用方程构建
65.差别来历生物炭对砷在泥土中吸附与解吸的影响
66.生物炭出产与农用的意思及国际外静态
67.秸秆生物反应堆与菌肥对温室番茄泥土微情况的影响
68.生物炭对泥土肥料的感化及将来研讨
69.玉米秸秆生物炭对泥土无机氮素淋失危险的影响研讨
70.黄土丘陵区生物结皮对泥土可蚀性的影响
71.内蒙古草甸草原与典范草原公开生物量与出产力季候静态及其碳库潜力
72.生物炭增添对黄土高原典范泥土田间持水量的影响
73.生物炭对黄土区泥土水份入渗、蒸发及硝态氮淋溶的影响
74.生物炭及其复合资料的制备与操纵研讨停顿
75.生物炭及炭基硝酸铵肥料对泥土化学性子及作物产量的影响
76.臭冷杉生物量分派款式及异速成长模子
77.施用生物炭后塿土泥土微生物及酶活性变更特色
78.宁夏荒凉草原差别群落生物多样性与生物量干系及影响因子阐发
79.中国生物多样性查询拜访与掩护研讨停顿
80.三种小球藻生物柴油品德目标评估
81.AM真菌对重金属净化泥土生物修复的操纵与机理
82.含怀抱偏差的黑龙江省首要树种生物量相容性模子
83.生物炭与农业情况研讨回首与瞻望
84.氮磷增添对巨桉幼苗生物量分派和C:N:P化学计量特色的影响
85.生物炭对泥土肥力与情况品德的影响机制与危险剖析
86.西南林区自然白桦相容性生物量模子
87.氮肥与生物炭施用对稻麦连作体系甲烷和氧化亚氮排放的影响
88.黄土高原丘陵区生物结皮泥土的斥水性
89.检测食物梵衲氏菌的生物传感器耐久性研讨
90.生物炭对砂壤土节水保肥及番茄产量的影响研讨
91.泥土碳出入对秸秆与秸秆生物炭还田的呼应及其机制
92.按捺烟草青枯病型生物无机肥的田间防效研讨
93.生物炭对塿土泥土含水量、无机碳及速效营养含量的影响
94.生物炭对宁夏引黄灌区水稻产量及氮素操纵率的影响
95.茶叶生归天学研讨停顿
96.鄂尔多斯盆地西缘奥陶纪生物礁根基特色、散布纪律及成礁形式
97.中国实行《生物多样性条约》二十年:步履、停顿与瞻望
98.差别时代施用生物炭对稻田N_2O和CH_4排放的影响
99.生物炭对举措措施连作黄瓜根域基质酶活性和微生物的调理
100.生物无机肥对连作蕉园香蕉出产和泥土可培育微生物区系的影响
101.柴达木盆地几种荒凉灌丛植被的生物量分派款式
102.牛粪生物炭对磷的吸附特色及其影响身分研讨
103.红树林动物生物量研讨停顿
104.农业勾当及转基因作物对农田生物多样性的影响
105.煤矸石场植被自然规复早期木本动物生物量研讨
106.铁改性生物炭对磷的吸附及磷形状的变更特色
107.青藏高原草地公开生物量与情况因子的干系
108.蔬菜莳植庄家施用生物农药志愿研讨
109 生物炭对夏玉米成长和产量的影响
110.差别生物炭增添量下植烟泥土营养的淋失
111.生物DNA条形码:十年成长进程、研讨标准和功效
112.生物炭和生物炭基氮肥的理化特色及其作物肥效评估
113.木质素与生物燃料出产:降落含量或消除束厄局促?
114.生物炭增添对半干旱地域泥土温室气体排放的影响
115.磷收受接管对厌氧/好氧瓜代式生物滤池蓄磷/除磷的影响
116.天山林区六种灌木生物量的建模及其器官分派的顺应性
117.非形式生物转录组研讨
118.增添生物炭对灌淤土泥土营养含量和氮素淋失的影响
119.生物炭和腐植酸类对猪粪堆肥重金属的钝化成果
120.间伐对川西亚平地粗枝云杉野生林细根生物量及碳储量的影响
121.生物多样性信息学研讨停顿
122.长白落叶松林龄序列上的生物量及碳储量分派纪律
123.差别烧制温度下玉米秸秆生物炭的性子及对萘的吸附机能
124.操纵农业生物多样性延续节制无害生物
125.腾格里戈壁西北缘4种灌木的生物量瞻望模子
126.生物炭碳封存手艺研讨停顿
127.猪粪制备的生物炭对西维因的吸附与催化水解感化
128.生物炭修复泥土重金属净化的研讨停顿
129.古尔班通古特戈壁4种荒凉木本动物差别成耐久的生物量分派与叶片化学计量特色
130.生物炭笼盖对底泥净化物开释的影响
1.DGGE手艺的道理
变性梯度凝胶电泳（DGGE）是按照小片断DNA份子（1kb以下）的溶化温度差别来阐发DNA份子的多样性，实际上可以或许或许或许或许或许或许或许或许检测到单个碱基替代的DNA份子。DN段在丙烯酰胺凝胶中的迁徙率取决于本身的物理性状，溶化状态的DNA份子片断在聚丙烯酰胺凝胶中的迁徙速率比双链DNA份子慢[4]。当DN段处在变性剂浓度不时增添的凝胶体系中，跟着电泳的迁徙就会局部熔化，到达必然变性剂浓度时DNA就会溶化为单链的份子，这些团圆的碎片集合在一个比拟狭小的变形梯度规模内，如许差别的DNA份子在差别变性剂浓度下溶化，在全数电泳图谱中成楼梯式摆列。经由进程对比溶化状态下DN段的多态性，便可以或许或许或许或许或许或许或许或许猜测有碱基渐变或序列差别的DNA份子片断。
为了前进检出率可在DNA一端插手一个高熔点区―GC夹（GC clamp）；GC夹便是在一侧引物的5′端加上一个30～40bp的延续GC碱基，如许在PCR产品的一侧可发生一个GC夹的高熔点区，从而使呼应的局部序列处于低熔点区而便于检测阐发；如许，DGGE的渐变检出率可前进到靠近于100%[4]。
2.DGGE手艺在微生物生态学中的操纵
自然界中85%～99.9%的微生物是不可纯培育的[5]，并且微生物的形状具备难察看性和可变性，在传统的测验考试体例下不能供给充沛的微生物学信息，这严峻障碍了对自然情况中微生物构成及特色的客观熟悉。PCR-DGGE 手艺在微生物生态学中的一个最首要的操纵便是阐发微生物群落构成，Muyzer 等人于1993年初次将DGGE手艺操纵于微生物膜体系和生物菌苔的群落多样性阐发。尔后，该手艺被遍及操纵于各类微生物生态体系的检测，绝大局部研讨都是经由进程扩增原核生物 16S rDNA 基因来研讨各生态体系中的古细菌或细菌的群落多样性[6]，或用真菌的通用引物扩增18SrDNA 基因，从而研讨真菌的群落多样性，别的除经由进程rDNA基因来阐发微生物群落布局构成外，还可以或许或许或许或许或许或许或许或许经由进程扩增功效性基因来研讨功效基因及功效菌群的差别。
Lam等操纵DGGE手艺对真菌18SrDNA的序列停止阐发，研讨Magnolia liliifera叶片中真菌的多样性，成果在叶片的差别部位取得经由进程培育和形状学研讨未能取得的14株差别菌株[7]。Eeva等对挪威红杉残枝样本间接停止DNA提取，操纵DGGE阐发经由进程FR1和NS1引物对扩增的1650 bp rDN段，成果取得了46株木料腐臭真菌，为真菌群体中难培育的菌株的检测供给了新的体例[8]。Zhou等对藏灵菇发酵液里的真菌和细菌的DNA停止提取后，扩增细菌16SrRNA和真菌28SrRNA上的呼应片断，以后用DGGE停止阐发取得11株上风菌株，并且在差别样本之间细菌存在78～84%的近似度，酵母存在80-92%的近似度[9]。
PCR-DGGE 手艺在微生物生态学中的别的一个首要操纵是检测微生物的静态变更。宋亚娜等操纵16SrDNA和18S rDNA特同性引物对，将泥土中提取的总DNA停止PCR扩增后，经由进程DGGE手艺对PCR产品停止阐发，研讨差别间作和连作莳植体系对作物根际真菌和细菌菌落布局的影响，成果标明，间作较着转变玉米的根际细菌、真菌的菌落布局[10]。Takada操纵PCR-DGGE研讨化学熏蒸后对散土和菠菜根部泥土中真菌群落的变更，成果标明，三氯硝基甲熏蒸两个月后，在散土和菠菜根部泥土中真菌的多样性都削减，并且一年后真菌的多样性并不完整规复到本来的程度，可是菠菜根部泥土中真菌削减量比散土中要少，1，3-二氯丙烯处置两个月后，真菌的多样性只发生细小的转变，并且六个月后就与对比组不较着差别了[11]。
PCR-DGGE手艺还可用于发明新的微生物菌株。Santegoeds等经由进程DGGE阐发细菌16SrRNA上的基因片断来检测屡次富集培育的菌藻系，取得了14条怪异的16SrRNA基因序列，此中有10个细菌株的基因是以前操纵纯培育手腕及纯真的份子手艺体例均不发明的[12]。
3.DGGE手艺的规模性及改进体例
DGGE 手艺作为一种份子生物学手腕在研讨微生物群落的静态步履和庞杂性方面阐扬侧首要的感化，是今朝被遍及接管的的份子生物学东西，可是作为一种份子程度上的手艺，除具备大都份子手艺所固有的错误谬误之外（如PCR产品偏差等），本身也有必然的操纵规模性。
起首，操纵DGGE分手的PCR产品通俗请求DNA长度在200～ 700bp规模内[1]，超越该规模DGGE的分辩率会降落，可是这些序列只能供给无限的体系发育信息，倒霉于判定微生物所属的体系类群。其次，DGGE凡是显现的是微生物群落中的上风种群，Muyzer研讨发明该手艺只能对菌体数目大于总菌量1%的菌群停止阐发[1]。再次，每种菌可以或许或许或许或许或许或许或许或许含有数目不等的rRNA基因[13]，则可以或许或许或许或许或许或许或许或许会致使群落中菌株数目被过量的估量从而强调群落差同性和多态性。别的，若是选用的前提不是出格适合就不能保障将每类DN段完整分隔，如许序列差别的DN段迁徙到凝胶的统一地位，致使统一条带中含有差别品种的细菌[14]。
对DGGE存在的这些缺限咱们可以或许或许或许或许或许或许或许或许经由进程各类手腕加以改进，比方可以或许或许或许或许或许或许或许或许优化电泳及PCR的前提从而削减偏差，并且在停止DGGE之前经由进程软件来阐发检测PCR进程中构成的嵌合体，别的，可以或许或许或许或许或许或许或许或许与其余手艺体例相连系，如纯培育、间接形状察看、原位杂交、核酸探针检测手艺等，如许不只更客观的从多方面反应情况中微生物的多样性信息，还可以或许或许或许或许或许或许或许或许与其余体例彼此补充，从而不时前进份子微生物生态学的研讨程度。DGGE手艺与传统体例或别的份子生物手艺的连系进一步增进了人们对微生物生态的熟悉；跟着份子生物学手艺的疾速成长，DGGE手艺将会取得不时的补充和完美，必将在微生物生态研讨中阐扬更大的感化。
【参考文献】
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中图分类号：Q93-335 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）10-2295-04
嗜碱菌是一类最适成擅长pH大于或即是9的情况中的微生物，按照它们在pH 7 前提下成长与否可分为专性嗜碱菌和兼性嗜碱菌两大类[1，2]。对嗜碱菌新菌株的分手、碱性卵白酶的基因克隆和操纵、极度情况顺应机制、布局新奇的活性产品的分手都是现今极度情况微生物研讨的热点[3-6]。嗜碱菌已遍及操纵于发酵财产、煤油化工、农作物成长改进和情况净化物的生物修复等多个范畴[7，8]。今朝，对嗜碱菌的嗜碱机理研讨又有了新的首要冲破[9]。
内蒙古有广漠的盐碱湖散布，储藏着丰硕的微生物资本，此中嗜碱微生物显现较高的生物多样性[10，11]。嗜碱菌有很高的经济代价和出产操纵潜力，对其停止深切研讨和开辟操纵，将成为我国计谋生物资本的平台之一，有益于阐扬生物手艺立异的支持感化。是以，对分手于浑善达克盐碱湖的一株嗜碱菌的根基特色停止了阐发，以期为进一步熟悉和开辟内蒙古地域的极度情况微生物资本奠基根本。
1 资料与体例
1.1 资料
1.1.1 盐碱湖杆菌菌株 盐碱湖杆菌菌株MIM18由内蒙古农业大学性命迷信学院操纵与情况微生物研讨所从内蒙古浑善达克盐碱湖平分手取得。
1.1.2 培育基
1）液体培育基。酵母粉2 g/L，卵白胨2 g/L，K2HPO4 0.2 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，NaCl 10 g/L，微量元素1 mL/L，微生素 100 μL/L，pH 9～10。
2）固体培育基。在液体培育基中插手琼脂15 g/L制成。
3）半固体培育基。在液体培育基中插手琼脂4 g/L制成。
4）微量元素溶液配方（g/L）。FeCl3 0.05，MnSO4·H2O 0.02，H3BO3 0.01， CuSO4·5H2O 0.01，（NH4）6Mo7O24 ·4H2O 0.02，ZnSO4 0.01 g，EDTA 0.5，CaCl2·2H2O 0.2。
5）微生素溶液配方（g/L）。生物素 0.02，VB1 0.02，VB12 0.001，硫酸楚 0.05。
1.2 体例
1.2.1 形状特色和成长曲线的绘制 经由进程革兰氏染色战争皿划线培育的体例来察看MIM18的根基形状特色。将MIM18菌种接种于含100 mL液体培育基的250 mL三角瓶中，置33 ℃、200 r/min水浴摇床光照培育。隔时取样于600 nm处测定吸光度。以培育时候为横坐标，吸光度为纵坐标绘制成长曲线。
1.2.2 耐盐测验考试 调剂培育基中盐浓度别离为0、10、20、30、40、50、55、60 g/L。固体培育基平皿划线光照培育测定MIM18的耐盐程度；液体培育基（装液量为100 mL/（250 mL），接种量2%）33 ℃、200 r/min水浴摇床培育3 d后于600 nm处测定吸光度，每一个梯度3个平行[12，13]。
1.2.3 pH对成长的影响 调剂培育基的pH别离为5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、11.0、11.5、12.0，培育测定体例同1.2.2。
1.2.4 温度对成长的影响 接纳含NaCl的培育基，别离置于0、24、27、30、33、36、40、42 ℃的前提下培育，培育测定体例同1.2.2。
1.2.5 氧气对成长的影响 半固体培育基穿刺培育，每12 h察看一次。察看菌体的成长情况及地位。液体静置和摇床培育，察看菌体在液体中的散布。
1.2.6 光照对产色素的影响 划线接种固体培育皿3个，两个平皿用锡箔纸包住避光培育，24 h后将锡箔纸中的一个平皿光照培育，别的一个仍避光培育，第三个平皿一向光照培育。
1.2.7 产酶品种和抗生素敏理性阐发 产酶品种测定参考《罕见细菌体系判定手册》[14]和文献[15]中的体例停止。抗生素敏理性测验考试接纳药敏纸片检测法[16]停止。
2 成果与阐发
2.1 MIM18的成长曲线
经由进程7 d的恒温摇床培育和吸光度测定，绘制出MIM18的成长曲线（图1）。从图1可以或许或许或许或许或许或许或许或许清楚看到0～12 h为延滞期，12～72 h为指数成耐久，72～120 h为不变期，120 h掉队入兴起期。
2.2 盐浓度对MIM18成长的影响
颠末培育，MIM18可在盐浓度0～55 g/L规模内成长。对比各盐浓度的成长状态发明，在盐浓度0～40 g/L时均能较好地成长。盐浓度为0 g/L时，菌落的色彩较着淡于盐浓度10～40 g/L时的菌落色彩（图2、图3）。盐浓度为50 g/L时，有大都菌落成长，盐浓度为55 g/L时只要5个摆布的小菌落，盐浓度≥60 g/L时几近不成长。申明低盐有益于MIM18的成长，太高的盐浓度将会按捺其成长。经由进程差别盐浓度培育后测定吸光度比拟发明（图4），MIM18在盐浓度0～10 g/L规模内跟着盐浓度降落有益于MIM18的成长，在盐浓度为10 g/L时成长情况最好；在盐浓度10～40 g/L时按捺MIM18的成长，但按捺成果不较着，当盐浓度为40 g/L以上时MIM18的成长较着遭到按捺。
2.3 pH对MIM18成长的影响
经平板培育可知，MIM18顺应pH变更才能较强，能在pH 6.0～11.0情况下成长。当pH≤5.5或≥11.5时该菌株不成长。当pH 6.0、7.0和11.0时该菌株成长比拟迟缓；pH 8.5～10.0时MIM18成长随pH的增大逐步加速，pH 9.5时最适成长，成长最快，也最早到达不变期，以后成长量随pH增大而减小（图5）。
2.4 温度对MIM18成长的影响
经平板培育可知，MIM18的成长温度规模为24～40 ℃，大于40 ℃时不再成长。从图6可以或许或许或许或许或许或许或许或许看出，33～36 ℃为MIM18成长的适合温度规模。
2.5 氧气对MIM18成长的影响
半固体培育基穿刺光照培育24 h后，穿刺孔上部有成长迹象，以后半固体斜面成长迹象加强，穿刺孔中成长迹象逐步削弱直至消逝；液体培育时，只在液面处成长，申明氧气是MIM18成长的须要前提，MIM18不具备活动性。摇床振荡培育与静置培育对比成果标明摇床培育前提下MIM18的成长状态较着优于静置培育，申明摇床培育供给的氧气对MIM18成长有首要感化。
2.6 光照对MIM18产色素的影响
如图7所示，3种光照处置体例下MIM18成长状态、菌落形状根基分歧，申明光照对MIM18的色素分化甚至成长无影响。
2.7 MIM18的产酶品种和抗生素敏理性
经测定，该菌株在成长中发生打仗酶（过氧化氢酶）、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶，不发生脲酶、苯丙氨酸脱氨酶、酯酶；甲基红和硫化氢测验考试为阳性；它对罕见的抗生素（青霉素-G、红霉素、氯霉素、四环素、庆大霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、罗红霉素、多粘菌素、卡那霉素、妥布霉素、利福平、杆菌肽）均表现为高度敏感。
3 论断与会商
MIM18在盐浓度0～40 g/L规模内都能较好成长，顺应才能较强，甚至在无盐前提下也能成长，在盐浓度10 g/L时就可以或许或许到达最适盐浓度，申明其成长对盐量请求不大，当盐浓度跨越40 g/L时成长较着遭到了按捺，是以MIM18不是嗜盐菌[10]；MIM18不只能在强碱前提下成长并且能在pH 7下成长，是以是兼性嗜碱菌[11]。别的，MIM18在温度方面请求也不很是严酷，30～36 ℃成长差别不是很大。MIM18对pH和四周情况的氧气质变更很敏感，氧气是其成长的须要前提，光照对其色素分化甚至成长不影响。
嗜碱菌是盐碱湖中数目大、散布广的极度微生物。因为其怪异的情况顺应形式，出格的心理机制，怪异的基因范例，并有多种代谢产品可以或许或许或许或许或许或许或许或许操纵，是以不只成了性命迷信实际研讨的抱负资料，并且成为一类具备很大开辟潜力的生物资本[17]。比来几年来，嗜碱微生物的研讨成长敏捷，已操纵于诸如洁净剂出产[18]、生物外表活性剂[19]、农作物成长增进剂[20]和自然产品的生物转化、情况净化物降解[8，21，22]等多个方面。对盐碱湖菌的深切研讨，不只可以或许或许或许或许或许或许或许或许开辟新的微生物基因资本，并且将大大增进微生物在人类安康、情况掩护和生物手艺等范畴的操纵。
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中图分类号 S451 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）20-0084-03
Effects of Lantana camara Invasion on Soil Physical-chemical Properties in Rhizosphere and Non-rhizosphere Zone
KANG Xiao-wu DAI Ting-ting
（Institute of Tropical and Subtropical Ecology，South China Agricultural University，Guangzhou Guangdong 510642）
Abstract The effects of L.camara invasion on rhizosphere and non-rhizosphere soil nutrients，soil enzyme activities，microbial biomass with microbial functional diversity were studied by quadrat experiment in the field.The experimental results showed that the invasion of L.camara significantly improved the content of soil organic matter，total nitrogen，total potassium，nitrogen，available phosphorus，potassium and microbial biomass carbon，nitrogen，phosphorus.At the same time，the invasion significantly improved the activity of soil urease，protease，sucrosemetabolic，cellulase，catalase and the metabolic activity，carbon source utilization and diversity index of soil microbial community.The promoting effect was higher on the rhizospheric soil than on the non-rhizospheric soil （bulk soil）.
Key words bioinvasion；Lantana camara；rhizosphere soil ；soil physical-chemical properties
马缨丹（Lantana camara）为马鞭草科（Verbenaceae）马缨丹属（Lantana）多年生常绿灌木，原产于寒带美洲，现遍及散布于寒带、亚寒带和温带地域，是天下上危险最严峻的100种无害外来入侵物种之一[1]。马缨丹作为一种外来入侵动物，植株滋生才能强，舒展敏捷，可以或许或许或许或许或许或许或许或许在短时候内大面积侵犯丛林、果园、牧场和农耕地，粉碎本地的生物多样性和自然生态体系，并因其植株有毒而严首要挟到人畜安康和农牧业出产[2-3]。1645 年马缨丹作为一种抚玩花草引入我国，现已在广东、广西、海南、云南等地大批舒展分散，对本地的生物多样性、农业出产和生态宁静构成严首要挟[4-5]。
有研讨标明，一年蓬（Erigeron annual Fleabane）、加拿大蓬（Erigeron canadensis）、加拿大一枝黄花（Solidago canad-ensis）等动物入侵后对根际泥土理化性子发生了差别程度的影响[5-6]；外来入侵动物紫茎泽兰（Eupatorium adenopho-rum）、黄顶菊（Flaveria bidentis）等可以或许或许或许或许或许或许或许或许差别程度地前进入侵地泥土的全磷营养和速效营养[7-8]。今朝，国际外学者在马缨丹的生物学特色、散布危险、防治和开辟操纵等方面展开了大批的任务，但对马缨丹植株的化感感化及其入侵对泥土微生态特色的影响研讨较少[9-15]。笔者经由进程田野样方测验考试，研讨了马缨丹入侵对根际、非根际的泥土营养、泥土酶活性、泥土微生物生物量与泥土微生物功效多样性的影响效应，旨在从化感感化、泥土反应感化的角度摸索马缨丹的入侵机制及入侵效应，从而为更好地办理、节制马缨丹的入侵危险供给迷信按照。
1 资料与体例
1.1 测验考试资料
马缨丹单优群落的根际泥土与非根际泥土均采自于华南农业大学增城讲授基地。
1.2 测验考试体例
在华南农业大学增城讲授科研基地，拔取马缨丹单优群落（马缨丹植株笼盖率80%～90%，群落高度150～250 cm，入侵年限大于6年）内的硬朗植株，用锄头挖取植株公开根系（0～20 cm），抖去根系上的大块泥土，尔后用细毛刷刷取根系表层黏贴的泥土，去除杂质后作为根际泥土，而拌掉队的大块泥土作为非根际泥土；同时拔取间隔马缨丹群落50 m之外，且四周都不马缨丹植株成长的荒坡草地的表层泥土（0～10 cm）作为对比（CK）。每一个处置3次反复，每次反复之间相隔200 m以上。将收罗的泥土装袋运回测验考试室，此中一局部土样置于室内自然风干，撤除动动物残体，研磨过100目筛，用于泥土营养含量、泥土酶活性的测定阐发；别的一局部样品临时冷藏于-18 ℃冰箱，用于测定泥土微生物生物量碳、氮、磷。
1.3 数据统计体例
一切测验考试数据均在Microsoft Excel上实现处置，经由进程SPSS 13.0停止方差阐发（one way ANOVA），并接纳Duncan新复极差法停止多重比拟。
2 成果与阐发
2.1 马缨丹入侵对根际、非根际泥土全量、速效营养的影响
2.1.1 泥土全量营养。泥土无机质、全氮（TN）和全钾（TK）含量在遍地置中的变更纪律分歧，即根际泥土的含量最高，非根际泥土次之，CK的含量最小，遍地置的差别较着（表1）。此中与 CK比拟，根际泥土的无机质、TN和TK含量别离增添40.77%、38.13%、30.16%；而与非根际泥土比拟，则别离增添23.24%、14.97%和13.11%。对泥土TP含量，根际泥土别离比CK、非根际泥土增添65.22%、58.33%，差别较着；而非根际泥土的TP含量虽略高于CK，但差别不较着。申明马缨丹入侵能较着前进本身根际的泥土无机质、TN、TP和TK含量，同时也较着前进非根际的泥土无机质、TN和TK的含量，但绝对而言，其对根际泥土营养的晋升成果加倍较着。
2.1.2 泥土速效营养。在3个处置中，马缨丹根际泥土的碱解氮含量最高，并且较着高于非根际泥土和CK，而非根际泥土的碱解氮含量固然略高于CK，但二者的差别不较着（表2）。对泥土的速效磷、速效钾含量，均表现为根际泥土的含量最高，非根际泥土的含量次之，CK的含量最低，遍地置间的差别较着。此中与CK比拟，根际、非根际泥土的碱解氮含量别离增添32.67%和0.75%，速效磷含量别离增添87.14%和48.87%，速效钾含量别离增添115.70%和62.72%，可见马缨丹入侵能较着前进泥土碱解氮、速效磷和速效钾含量，出格是对根际泥土的营养晋升感化更强。
2.2 马缨丹入侵对根际、非根际泥土酶活性的影响
与CK比拟，马缨丹入侵较着前进了泥土脲酶、卵白酶活性，此中根际泥土的脲酶、卵白酶活性别离比CK前进104.06%和74.34%，非根际泥土的脲酶、卵白酶活性也别离比CK增添45.53%和46.90%。可见，马缨丹入侵对根际泥土脲酶、卵白酶活性的增进成果更强。泥土蔗糖酶、纤维素酶的活性变更也显现近似的纪律，即在3个处置中均表现为根际、非根际泥土的酶活性较着高于CK，且根际泥土的酶活性亦较着高于非根际泥土（表3）。此中根际、非根际泥土的蔗糖酶活性别离是CK的227.56%和157.11%，纤维素酶活性别离是CK的264.39%和161.73%。可见，马缨丹入侵能较着前进根际、非根际泥土中蔗糖酶和纤维素酶的活性，加强对泥土中无机碳的操纵，并且这类加强效应在根际泥土的表现更加较着。别的，马缨丹入侵亦能较着前进本身根际、非根际泥土的过氧化氢酶活性，与CK比拟，其增幅别离到达45.95%和27.03%
2.3 马缨丹入侵对根际、非根际泥土微生物生物量的影响
泥土微生物生物量碳、氮、磷含量在各个处置中的变更纪律分歧，均表现为根际、非根际泥土含量较着高于CK，同时根际泥土含量亦较着高于非根际泥土（表4）。此中与CK比拟，根际泥土微生物生物量碳、氮、磷的含量别离前进238.76%、53.55%、243.61%，非根际泥土微生物生物量碳、氮、磷含量也别离前进130.31%、14.34%、124.15%。可见，马缨丹入侵对根际泥土微生物生物量碳、氮、磷含量的晋升效应更强。
2.4 马缨丹入侵对根际、非根际泥土微生物群落功效多样性的影响
2.4.1 泥土微生物群落代谢活性。平均孔色彩变更率（average well color development，AWCD）反应泥土微生物操纵碳源的全体才能与代谢活性，也是评估操纵单一碳源才能的首要目标，可作为微生物全体活性的有用目标。AWCD 值的变更（斜率）和终究能到达的值反应了泥土微生物操纵某一碳源物资的才能。由图1可知，遍地置中泥土微生物的AWCD值均跟着培育时候的耽误不时回升，变更趋向分歧。在最后的24 h内AWCD变更较小，24～72 h急剧回升，尔后延续迟缓降落。培育时代CK泥土微生物群落的AWCD值均处于较低程度，根际泥土微生物群落的AWCD值则处于最高程度，遍地置的AWCD在全数培育周期内均表现为根际泥土>非根际泥土>CK，此中根际泥土在培育24 h后一向到培育竣事，其微生物群落的AWCD值均较着高于CK，亦较着高于非根际泥土；而非根际泥土在0～72 h内的AWCD值与CK差别不较着，72 h后与CK差别较着。这申明马缨
丹入侵后较着前进了泥土微生物群落的代谢活性，并且对根际泥土的影响效应更较着。
2.4.2 泥土微生物群落碳源操纵率。在6类碳源中，马缨丹非根际泥土微生物群落对氨基类、酚类碳源的操纵率与CK的差别不较着，但对其余碳源的操纵率则较着高于CK（表5）。而根际泥土微生物群落对6类碳源的操纵率均较着高于CK，亦较着高于非根际泥土，此中根际泥土微生物群落对碳水化合物类、羧酸类、聚合物类、氨基酸类、酚类和胺类碳源的操纵率别离比CK增添96.91%、83.70%、82.43%、41.13%、55.74%和110.45%。可见，马缨丹入侵较着前进了泥土微生物群落对6种碳源的操纵率，出格对根际泥土的改进感化更强。
2.4.3 泥土微生物群落碳源操纵的多样性。与CK比拟，马缨丹入侵较着前进了根际泥土微生物群落的Shannon-Wiener指数H′、Mc Intosh指数U、丰硕度指数S和Simpson上风度指数Ds，而非根际泥土微生物群落的Mc Intosh指数U、丰硕度指数S也较着回升。对Pielou平均度指数E，遍地置的差别均不较着。申明马缨丹入侵可以或许或许或许或许或许或许或许或许增进泥土微生物群落功效多样性的前进，出格对根际泥土的影响更强。
3 论断与会商
动物对泥土营养的接收操纵与泥土对动物成长发育进程中的反应感化是物种合作取胜的首要驱动机制之一[16]。大大都研讨指出，外来动物入侵可以或许或许或许或许或许或许或许或许加速泥土营养轮回进程，前进泥土肥力，有益于增进本身的进一步入侵分散。外来动物皱果苋入侵后，泥土中碳、氮、磷的浓度较着回升，此中入侵区的全磷、可溶性磷几近别离前进3倍和2倍[17]。泥土酶首要来历于泥土微生物的代谢进程和泥土中动物、动物的活体排泄或残体分化，可以或许或许或许或许或许或许或许或许到场泥土生态体系良多首要的生归天学进程和物资轮回，经由进程催化泥土中的生化反应阐扬首要感化，可以或许或许或许或许或许或许或许或许客观地反应泥土肥力状态与体系功效[18-21]。泥土微生物生物量是泥土中最活泼的肥力因子之一，到场泥土无机质分化、腐殖质构成和泥土营养的轮回转化进程，可以或许或许或许或许或许或许或许或许反应泥土异化与矿化才能的凹凸，是泥土生态体系肥力的首要生物学目标[22]。在外来动物与本地动物的干系中，泥土微生物群落可以或许或许或许或许或许或许或许或许起到了桥梁感化，外来动物经由进程转变泥土微生物群落的布局构成、区系数目与心理功效，粉碎土人动物与泥土微生物在耐久演变进程所构成的均衡共生干系，影响土人种的资本取得、成长滋生与种群更新，从而使本身在合作中取得更大上风，胜利入侵[23-25]。
本研讨成果标明，马缨丹入侵后，根际、非根际泥土的无机质、全氮、全磷和全钾均较着回升，并且马缨丹入侵对根际泥土营养的晋升成果更加较着，根际泥土的无机质、全氮、全钾含量均较着高于非根际泥土。同时，马缨丹入侵亦能较着前进泥土的速效营养，马缨丹根际、非根际泥土中的碱解氮、速效磷和速效钾均较着高于对比；并且马缨丹根际泥土的速效营养亦较着高于非根际泥土。可见，马缨丹入侵较着前进了泥土差别肥力特色，且对根际泥土肥力的前进感化更强，而根际泥土的营养更有益于根系的接收操纵，这可以或许或许或许或许或许或许或许或许是马缨丹可以或许或许或许或许或许或许或许或许入侵胜利和疾速扩大舒展的生态机制之一。马缨丹的入侵较着前进了泥土脲酶、卵白酶、蔗糖酶、纤维素酶和过氧化氢酶的活性，且根际泥土酶的活性均较着高于非根际泥土。这申明马缨丹的入侵有益于泥土营养物资的轮回转化进程。入侵区泥土酶活性较高，这将有益于活化泥土营养，前进其有用性，进而增进本身的入侵舒展。马缨丹入侵可以或许或许或许或许或许或许或许或许较着前进泥土微生物生物量碳、氮、磷的含量，且根际泥土的微生物生物量碳、氮、磷含量较着高于非根际泥土。马缨丹入侵后能较着前进泥土微生物群落的代谢活性、碳源操纵率和多样性指数，并且其对根际泥土的影响效应较着高于非根际泥土。申明马缨丹入侵后能经由进程前进本身生境泥土的微生物群落代谢活性从而增进泥土营养轮回与转化，这或许是马缨丹胜利入侵分散的缘由之一。本文仅研讨切磋了马缨丹入侵对泥土营养、泥土微生物生物量、泥土微生物功效多样性的影响效应，而对泥土微生物群落布局的变更及其反应感化，可进一步说明马缨丹胜利入侵和对本地动物成长影响的泥土生态学机理，此后可加强该方面的研讨。
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